血凝抑制试验结果判读「血凝血凝抑制试验质量控制及异常结果成因分析」

血凝-血凝抑制试验方法敏感性高、特异性强、速度快、成本低及操作方便，因此广泛用于新城疫、禽流感等疾病的流行病学调查、疫病诊断、免疫监测等工作中，但其结果受实验材料、操作技术的影响较大，笔者根据多年的操作经验，分析血凝-血凝抑制试验的质量控制要点，并探究常见异常结果成因，以期为同行参考。

一、质量控制

1、器材的选择及使用

1.1 微量反应板

应选择V型反应板，分为一次性及重复使用两种。重复使用应遵循反复冲洗、2～3%的盐酸浸泡过夜、蒸馏水反复冲洗、晾干程序；切忌煮沸消毒、高压灭菌及试管刷刷洗，以免变形及破坏光滑性。

1.2 吸头

有条件的单位最好选用新的，防止因磨损造成吸液不准确；若需重复使用，应经超声波清洗、高压灭菌后方可使用，并及时更新。

1.3 移液器

移液器应定期校准并遵循使用规范，注意：（1）在整个试验中，最好使用同一移液器以减小误差；（2）稀释液体时，要垂直插入，不可过深，反复吹打6～8次，确保混匀；（3）滴加四单位抗原时，最好悬空并防止液体溅出。

2、主要试剂

2.1稀释液

常用稀释液是生理盐水（0.9％氯化钠溶液）或PBS，按要求配制后，调整pH值为7.0 ～7.2并高压灭菌。

2.2 标准抗原、阳性血清、阴性血清

新购入抗原要检测其血凝价，如果与所标抗原价不符，应重新检测。抗原、血清要分装，-20℃保存，实验前将抗原、血清取出，使其完全融化。

2.3 待检血清

分离的待检血清可于4 ℃的冰箱保存5d， 时间若超过1周，需冰冻保存。检测冻结血清时，溶化后可采用上下颠倒的方式混匀，以防形成气泡及蛋白质变性。在使用中，应避免反复冻融，以不超过3～5个周期为宜。

3、试验操作

3.1 1％红细胞配制

最好采集同种3只以上非免疫公鸡的血液混合制作红细胞，以减少非特异性凝集现象。若是免疫过的鸡，需增加洗涤次数。特别注意：（1）吸取红细胞压积时要伸到底部，确保红细胞浓度正确。（2）加红细胞前，要摇匀，边摇边加，确保红细胞浓度一致；并且低浓度孔向高浓度孔加，以减少污染；（3）做同一次试验或测同一批样品时，不能更换红细胞，以免对结果判定造成影响。

3.2 四单位抗原的配制

HA试验时，建议同时进行至少3排抗原滴度的测定，确保抗原效价准确。注意：（1）配制后须作回归试验。若过高或过低，都应反复校准后才能用于HI试验；（2）做同一次试验或测同一批样品时，不能更换四单位抗原；（2）最好现用现配，室温下不可超过4h，4℃可保存一天，如时间过久，需重新检测HA效价；（3）滴加抗原时，要充分摇匀，确保每一孔浓度一致。

3.3感作条件

孵育温度对试验的影响较大，在 4～37 ℃范围内，感作温度直接影响着反应时间，应按照国家标准严格控制在室温（20～25 ℃），30～40min判定结果；另外抗原抗体反应时间对结果影响较大，应控制在室温，感作20min为宜，直到对照孔出现正确结果。

3.4结果判定

结果判定应以对照孔出现正确结果为依据，将微量反应板倾斜，以100％凝集的病毒最大稀释度为该病毒的血凝价，即HA效价；判定血清抗体滴度时，以100％抑制病毒凝集的血清最大稀释度为该血清的抗体滴度，即HI效价。

二、常见异常结果成因分析

1、对照孔凝集

血凝试验中稀释液对照孔的红细胞如出现凝集现象，可能原因如下：（1）稀释液中的氯化钠浓度过高或者被细菌污染；（2）红细胞被细菌污染或保存时间过长。

血凝抑制试验中血清对照孔应完全沉淀，如出现凝集现象除以上原因外，还可能与以下因素有关：（1）血清变质或被细菌污染（2）抗原血凝价测定得不准确导致作抗原浓度过高。

2、全部凝集

产生此种现象除稀释液对照孔凝集所述因素外，还可能与四单位抗原配制过高、红细胞配制浓度过低有关。

3、 抗原对照孔沉淀

血凝抑制试验中四单位抗原对照孔如果出现沉淀现象，可能是因为抗原血凝效价测定不准确，导致四单位抗原过低，不足以凝集红细胞。

4、泪滴状流淌(完全血凝抑制)线细

一般是由于温度低或作用时间短，结果还没有完全显示，需静置一段时间后再读数；也有可能红细胞浓度过低引起。

5、结果出现慢

20～25℃时，感作20～30min即可判定效价。当温度低于15℃时，往往需要超过40 min才能出现清晰的结果。

6、结果出现快，并且整板无凝集现象

超过30℃时，试验结果出现快，20 min左右就可读数。时间过长，结果就会消失，使整板无凝集现象，误判为抗原效价为0或者抗体效价为12 log2。

血凝-血凝抑制试验操作虽然简单，但是影响结果的因素较多，实际操作时应注意规范操作，同时应对异常试验结果进行分析，分析其成因，消除不利因素，减少试验误差，确保试验质量。

作者：杨翠玲